CCK8法測(cè)定細(xì)胞增殖注意事項(xiàng)

    CCK8全稱Cell Counting Kit-8，是一種基于WST-8（化學(xué)名為2-（2-甲氧基-4-硝基苯）-3-（4-硝基苯）-5-（2,4-二磺基苯）-2H-四唑單鈉鹽）的應(yīng)用于細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性的快速、高靈敏度檢測(cè)試劑盒。其工作原理類似于MTT，在電子耦合試劑存在的情況下，WST-8可以被線粒體內(nèi)的脫氧酶還原生成高度水溶性的橙黃色的甲臜產(chǎn)物（formazan）。顏色的深淺與細(xì)胞的數(shù)量有關(guān)。CCK8法在藥物篩選、細(xì)胞增殖測(cè)定、細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)、腫瘤藥敏試驗(yàn)以及生物因子的活性檢測(cè)等方面應(yīng)用廣泛。

注意事項(xiàng)：
    1、接種細(xì)胞應(yīng)選對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行，同時(shí)需要選擇合適的細(xì)胞濃度。
    2、檢測(cè)的時(shí)，試劑加入的時(shí)候沿著孔壁加入，不要產(chǎn)生氣泡，否則會(huì)干擾讀數(shù)。
    3、檢測(cè)OD值范圍在0.1-2之間，較為理想的OD值范圍為1-2。
    4、酚紅和血清對(duì)CCK8法的檢測(cè)不會(huì)造成干擾，可以通過(guò)扣除空白孔中本底的吸光度而消去。
    5、為了個(gè)人安全，建議穿戴實(shí)驗(yàn)服和一次性實(shí)驗(yàn)手套操作。

心得體會(huì)：
    1、同MTT實(shí)驗(yàn)一樣，96孔板的邊緣效應(yīng)，邊孔的水分蒸發(fā)很快，培養(yǎng)液及里面的藥物會(huì)出現(xiàn)濃縮現(xiàn)象，這樣會(huì)導(dǎo)致數(shù)據(jù)的誤差較大，因此在實(shí)驗(yàn)設(shè)置的時(shí)候，一般將邊孔留出為空白孔，在孔中加入液體，以使中間孔的水分飽和。
    2、懸浮細(xì)胞由于染色困難，一般需要增加細(xì)胞數(shù)量和延長(zhǎng)CCK8孵育時(shí)間。
    3、CCK8試劑保存時(shí)間，0-5℃下保存6個(gè)月，-20℃下避光保存1年。
    4、金屬對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有影響，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)想法將其去除。